Народився у передмісті Полтави. Походив із давніх козацьких і священицьких родин.

Після закінчення бурси у 1895—1901 рр. навчався у Полтавській духовній семінарії. Був виключений за вияв революційно-національних настроїв і запрошення до семінарії композитора М. Лисенка.

З 1900 р. — член Революційної Української Партії (РУП, 1905 року реорганізована в Українську Соціал-Демократичну Робітничу Партію).

Під загрозою арешту восени 1902 р. виїхав на Кубань, де працював учителем, архівістом (упорядковував документи Кубанського козацтва), був членом Чорноморської Вільної Громади РУП у Катеринодарі.

У грудні 1904 р. на конференції РУП у Львові виступив проти об'єднання з РСДРП. Декілька місяців навчався на університетських курсах українознавства у Львові, якими керував М. Грушевський.

На поч. 1906 р. редагував у Петербурзі партійний орган «Вільна Україна».

З липня 1906 р. — секретар київського щоденника «Рада», а від літа 1907 р. до 1908 р. — співредактор легального соціал-демократичного часопису «Слово».

З 1912 р. — редактор російськомовного журналу «Украинская Жизнь» (Москва), в якому публікувались М. Грушевський, Ц. Донцов, С. Русова, Є.Єфремов, М. Горький.

У роки Першої світової війни 1914—1918 рр. — працівник Союзу земств і міст, голова Українського Військового Комітету Західного фронту у Мінську. Своє ставлення до війни виклав у статті-відозві «Війна і українці». У цій публікації доводив, що українці лояльно виконують свій обов'язок перед Російською державою і висловлював надію, що в майбутньому ставлення російської влади до українського питання зміниться.

Був одним із провідних діячів української національно-демократичної революції: з березня 1917 р. — член Української Центральної Ради, з травня — голова Українського Військового Генерального Комітету, з червня — генеральний секретар військових справ.

У грудні 1917 р., не погоджуючись із курсом на замирення з Німеччиною (за іншою версією — на знак протесту проти пробільшовіцької орієнтації голови уряду В. Винниченка), пішов у відставку.

У січні-лютому 1918 р. сформував Гайдамацький Кіш Слобідської України і взяв активну участь у придушенні більшовицького повстання в Києві.

В період Гетьманату очолював Київське губерніальне земство і Всеукраїнський союз земств, організовав упорядкування могили Т. Шевченка і Чернечої гори у Каневі. За антигетьманський маніфест Всеукраїнського союзу земств у липні був заарештований.

Під час повстання проти гетьманського режиму у листопаді 1918 р. звільнений із в'язниці і обраний до складу Директорії УНР.

З листопада 1918 р. — Головний Отаман Армії Української Народної Республіки.

У лютому 1919 р. вийшов із УСДРП і став головою Директорії УНР, отримавши практично диктаторські повноваження.

На чолі об'єднаних українських збройних сил 30 серпня 1919 р. здобув Київ.

5 грудня 1919 р. виїхав у Варшаву для організації воєнно-політичного союзу із Польщею проти більшовицької Росії. За його ініціативою український і польський уряди підписали у квітні 1920 р. Варшавський договір.

Працюючи над створенням української армії, Петлюра зустрічав спротив деяких членів УЦР — вкрай пацифістську позицію зайняв Винниченко (навіть тоді, коли було цілком зрозумілим, що тільки воно здатне врятувати Республіку). Можливість вільно формувати власне військо Петлюра отримав на початку 1919 року, коли більшість керівників УНР почали втікати за кордон. Але шанси були набагато меншими, ніж у 1917 році; Петлюра очолив майже безсилу державу.

З листопада 1920 р. керував роботою екзильного уряду УНР у Польщі (Тарнув, Ченстохова, Варшава).

31 грудня 1923 р. виїхав до Австрії, а згодом — Угорщини, Швейцарії.

У жовтні 1924 р. оселився в Парижі, де організував видання тижневика «Тризуб» і продовжував виконувати обов'язки голови Директорії УНР і Головного Отамана УНР.

Стосовно звинувачень Петлюри в єврейських погромах в Україні, треба зазначити, що, будучи Головним Отаманом військ та головою Директорії УНР, Петлюра всіляко протидіяв погромам — їх чинили переважно банди під проводом отаманів і так званих «батьків» і деморалізовані частини більшовицьких військ. В УНР було засновано Міністерство єврейських справ, неодноразово ухвалювалися документи, які повинні були перешкодити розпалюванню міжнаціональної ворожнечі. Логічно, що законна влада намагалася навести лад на своїй території (1919 року було видано закон, який поновлював смертну кару — були організовані військово-польові суди), а більшовицькі вожді й агітатори провокували безлад і різанину, аби потім прийти в образі «месії».

Вбитий 25 травня 1926 р. анархiстом С.-Ш. Шварцбардом, який нібито помстився за родичів, що загинули під час єврейських погромів (більшість дослідників вважають, що він був агентом НКВС, а помста є лише приводом). Крім того, збереглася низка документів, підписаних Петлюрою й спрямованих проти тих, хто чинив погроми.

Похований на кладовищі Монпарнас у Парижі.